Научный архив: статьи

Введение. Межклеточное вещество культивируемых клеток представляет значительный интерес для исследователей, поскольку имеет ряд преимуществ перед децеллюляризированным межклеточным веществом тканей. In vitro возможно направленно модифицировать свойства продуцируемого межклеточного вещества за счет контролируемого изменения условий культивирования, что делает его универсальным материалом для использования в физиологических исследованиях и протоколах регенеративной медицины. Характеристика структур межклеточного вещества необходима для создания протоколов оценки качества и определения функциональных свойств получаемых бесклеточных конструктов. Цель данной работы – охарактеризовать структурные особенности фибриллярных компонентов межклеточного вещества мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток пупочного канатика человека на разных сроках культивирования.

Материалы и методы. Клетки культивировали в присутствии 2-фоcфо-L-аcкорбата натрия для продукции межклеточного вещества в течение 5, 7 и 10 суток. После удаления клеток фазово-контрастные фибриллярные структуры, а также окрашенные пикросириусом красным коллагеновые волокна исследовали с помощью фазово-контрастной и светлопольной микроскопии. Для морфометрии образцов межклеточного вещества использовали программы анализа изображения ImageJ и Matlab.

Результаты. Морфометрический анализ фазово-контрастных фибриллярных структур межклеточного вещества, а также коллагеновых волокон от мезенхимальных стромальных клеток на разных сроках показал, что длительность культивирования не влияла на геометрические параметры волокон (средний размер, общая длина и площадь). Оценка параметров сложности структуры выявила изменение микроархитектоники коллагенового каркаса за счет снижения лакунарности и увеличения изотропности.

Заключение. При увеличении длительности культивирования мезенхимальных стромальных клеток происходит ремоделирование коллагенового каркаса, приводящее к более упорядоченному изотропному распределению коллагеновых волокон. Соответственно, время созревания межклеточного вещества может быть использовано как фактор направленной модификации его свойств, что востребовано в исследованиях механизмов его участия в регуляции свойств клеток, а также в регенеративной медицине для создания тканеинженерных конструктов.

Введение. Известно, что в развитии ремоделирования миокарда при многих сердечно-сосудистых заболеваниях важную роль играют тучные клетки, однако их вклад в формирование миокардиального фиброза при артериальной гипертензии, осложненной гипертонической нефропатией, остается мало изученным.

Цель работы – исследовать морфофункциональные особенности тучных клеток в миокарде у пациентов с гипертонической нефропатией.

Материалы и методы. Проведен гистологический и морфометрический анализ образцов ткани миокарда, полученных в ходе аутопсии от пациентов с гипертонической нефропатией и без данной патологии. Изучению подлежали такие параметры как количество тучных клеток, их площадь и индекс дегрануляции. Дополнительно рассчитывалась площадь фиброза миокарда. Для оценки непараметрических показателей определяли медиану и интерквартильный интервал (25-й и 75-й процентили). Для сравнения двух независимых выборок использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Для выявления корреляционной связи между различными признаками был использован метод ранговой корреляции Спирмена.

Результаты. В миокарде пациентов с гипертонической нефропатией в сопоставлении с группой сравнения обнаружено увеличение количества тучных клеток, площади тучной клетки и индекса дегрануляции. Выявлена взаимосвязь между морфофункциональными параметрами тучных клеток и фиброзом миокарда.

Заключение. Обнаружено увеличение количества тучных клеток в 1,5 раза, их площади в 1,43 раза и индекса дегрануляции в 2 раза в миокарде пациентов с гипертонической нефропатией по сравнению с пациентами без данной патологии. Выявлена прямая корреляционная взаимосвязь между площадью фиброза миокарда левого желудочка и количеством тучных клеток, индексом дегрануляции тучных клеток и площадью тучной клетки.

Синдром Аарскога–Скотта относится к группе редких генетических (орфанных) болезней, характеризующихся преимущественным поражением длинных трубчатых и плоских костей черепа. Проявления синдрома многообразны, среди них наиболее часто встречаются умеренная задержка роста, пороки развития урогенитальной системы, задержка умственного развития, множественные аномалии лицевого черепа. Причиной синдрома Аарскога–Скотта являются мутации гена FGD1, расположенного в Х-хромосоме, что определяет высокий риск развития патологии у лиц мужского пола. Ген FGD1 кодирует одноименный белок, который функционирует как фактор обмена гуаниновых нуклеотидов и служит специфическим активатором ГТФазы CDC42. Через свой основной эффектор CDC42 FGD1 регулирует множество клеточных процессов, включая экспрессию генов, клеточную дифференцировку, поляризацию клеток, транспорт белков и организацию внутриклеточного цитоскелета. Цель обзора – представить данные об этиологии, патогенезе, разнообразии клинических проявлений синдрома, предполагаемых механизмах патогенеза. Наряду с этим освещены важные аспекты, связанные с этой редкой генетической болезнью.

Введение. Значимым фактором в распространении заболеваний животных являются зоофильные мухи, контроль численности которых осложняется проблемой инсектицидной резистентности, актуальной для ветеринарии и медицины во всем мире. Для мониторинга и диагностики устойчивости к инсектицидам в популяциях насекомых все большее применение находят молекулярные методы.

Цель исследования. Оценка распространения основных мутаций, ассоциированных с резистентностью к пиретроидам, фосфорорганическим соединениям и карбаматам, в трех природных популяциях Musca domestica L., собранных в 2021–2023 гг. в животноводческих помещениях Тюменской области.

Материалы и методы. Методом полимеразной цепной реакции с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов выполнено генотипирование генов CYP, vssc и ace-2. Результаты. Выявлена одна мутация в гене vssc (L1014F), связанная с устойчивостью к пиретроидам, и две мутации в гене ace-2 (G342A, G342V), обеспечивающие резистентность к фосфорорганическим соединениям и карбаматам. Резистентный аллель L1014F присутствовал у 40–70% исследованных особей всех трех популяций с частотой 30–55%. Аллель G342A обнаружен у 10 и 60% особей двух популяций с частотой 5 и 30% соответственно. Аллель G342V выявлен у 40% особей только одной популяции с частотой 25%.

Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о потенциале формирования устойчивости к пиретроидам, фосфорорганическим соединениям и карбаматам в исследованных популяциях Musca domestica, что необходимо учитывать при выборе средств для дезинсекции животноводческих помещений и защиты животных от насекомых. Дальнейшие молекулярные исследования Musca domestica из граничащих с Тюменской областью регионов будут полезны для выработки стратегии по сдерживанию распространения резистентных аллелей в локальных популяциях.

Введение. В связи с ростом числа заболеваний различной этиологии и развитием антибиотикорезистентности в последние несколько лет возросла значимость такого достижения человечества, как наноматериалы. Cравнительно небольшое количество данных (недостаток данных) о биораспределении, фармакокинетике, а также потенциальной токсичности нанометаллов для организма замедляет разработку более безопасных и эффективных лекарственных средств. Цель исследования. Анализ и обобщение данных современной научной литературы, посвященной изучению наночастиц металлов и наночастиц серебра, их распределения и влияния на организм человека и животных, а также по применению в сфере биомедицины и ветеринарии. Материалы и методы. Поиск источников производился в системах eLIBRARY. RU, cyberleninka. ru, scholar. google. ru, www. mdpi. com, www. researchgate. net, www. sciencedirect. com, базе данных PubMed. Использовалась литература, опубликованная за последние 6 лет, и более ранние исследования.

Результаты. Наноэлементы делят на органические, неорганические и гибридные. Одной из наиболее изученных неорганических наноструктур являются наночастицы металлов. Они находят широкое применение как в инженерии, так и в биомедицине (ветеринарии) в качестве бактерицидного и вирулицидного агента, средств для борьбы с раком, а также в сфере диагностики. На территории СНГ популярными нанометаллами являются наночастицы серебра. Известно, что на антибактериальную активность нанообъектов влияют их форма, размер и поверхностный заряд. Сейчас на фармацевтическом рынке существует несколько видов препаратов серебра, представленные в различных формах: коллоидное (катионное), кластерное и нульвалентное (металлическое) серебро. Препараты нульвалентного серебра наименее токсичные по сравнению с остальными. Лекарства на основе наноразмерных частиц можно вводить оральным, ингаляционным и дермальным способами, а также непосредственно в системный кровоток посредством внутрибрюшинной или внутривенной инъекции. Биораспределение металлических наноструктур зависит от типа частиц, их размера, поверхностного заряда, поверхностного покрытия, связи с белками, а также от путей воздействия, дозы и гидрофобности. Фармакокинетика наночастиц серебра не отличается от распределения наночастиц металлов, при этом наноразмерное серебро способно накапливаться в селезенке, печени, почках и легких, что может вызывать потенциальный токсический эффект.

Заключение. Необходимы дальнейшие углубленные исследования биораспределения, совместимости и потенциальной токсичности наночастиц, которые помогут разработать более эффективные и безопасные лекарственные препараты.

Введение. Современный ареал хламидийной инфекции сельскохозяйственных и диких животных охватывает почти все континенты. В настоящее время для постановки первичного диагноза, проведения скрининговых исследований и отдельных этапов эпизоотологических обследований с целью выявления хламидионосителей в нашей стране применяют «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных». При производстве средств диагностики важной задачей является обеспечение стабильности различных компонентов тест-систем в процессе их хранения и транспортировки. Одним из путей решения этой проблемы является стабилизация различных компонентов диагностических препаратов посредством лиофилизации.

Цель исследования. Отработка режима лиофилизации специфической хламидийной сыворотки, оценка ее соответствия характеристикам, заявленным в технических условиях на контроль тест-системы, и испытание стабильности этого компонента.

Материалы и методы. Сыворотку получали из крови овец, иммунизированных эмульсионным вакцинным препаратом штамма «АМК-16» Chlamydia psittaci. До проведения процедуры сублимации гипериммунные сыворотки замораживали до температуры минус 60 °С. Лиофилизацию сывороток проводили на аппарате Scientz 30F (Китай) двумя способами, различающимися температурными режимами и давлением в камере. Готовые препараты сывороток крови оценивали на соответствие техническим условиям диагностического набора. Полученные сублиматы закладывали на хранение на срок 24 мес. и исследовали в реакции связывания комплемента на протяжении этого периода.

Результаты. В ходе проведенных исследований было установлено, что наиболее эффективным оказался способ лиофилизации специфических сывороток, при котором процесс сублимации проходил при более низком давлении и наиболее высокой температуре нагрева. Оценка соответствия полученного препарата характеристикам, заявленным в технических условиях на тест-систему, показала, что качество сыворотки отвечало всем требованиям. Результаты изучения стабильности гипериммунной сыворотки продемонстрировали, что высушенный усовершенствованным способом препарат не теряет своей специфичности на протяжении 24 мес.

Заключение. В результате проведенной работы был отработан оптимальный режим лиофилизации специфической хламидийной сыворотки для диагностической тест-системы. Полученный препарат полностью соответствует характеристикам, заявленным в технических условиях на диагностикум. Установлено, что длительность хранения лиофилизированной сыворотки составляет не менее двух лет, в течение данного периода ее активность и физико-химические свойства не снижаются.

Введение. Воспалительные заболевания молочной железы коров остаются наиболее распространенной проблемой молочного скотоводства, несмотря на оптимизируемые профилактические меры и схемы лечения. Одним из способов предупреждения развития мастита у коров молочного направления продуктивности является генетическая селекция наиболее устойчивых к заболеванию особей. Толл-подобный рецептор 4 (TLR4) играет ключевую роль во врожденном иммунитете, в литературе имеются данные о его значимом влиянии на развитие мастита, описаны ассоциации генетических полиморфизмов гена TLR4 со значениями индекса соматических клеток.

Цель исследования. Определение генетического разнообразия и степени ассоциации с развитием клинического мастита для 3 полиморфных локусов, расположенных в гене TLR4. Материалы и методы. Для достижения поставленной цели использованы данные анамнеза крупного рогатого скота (n = 421), проведена диагностика субклинического мастита при помощи экспресс-теста для определения количества соматических клеток в молоке, при генотипировании крупного рогатого скота по полиморфизмам rs8193046, rs8193060, rs29017188 применена полимеразная цепная реакция в реальном времени по технологии TaqMan.

Результаты. При проведении ассоциативных тестов установлено, что полиморфизмы rs8193046 и rs29017188 являются наиболее перспективными кандидатами для использования в селекционных программах для снижения риска заболеваемости маститом в популяциях Уральского региона. Для rs8193060 отдельно достоверных результатов ассоциативных тестов не выявлено, однако животные с гаплотипом GCG (для аллелей SNP rs8193046, rs8193060, rs29017188) имеют статистически значимый более низкий риск развития мастита.

Заключение. Отмечено, что данные полиморфизмы можно использовать для маркер-ориентированной селекции крупного рогатого скота для профилактики риска развития мастита в популяциях Уральского региона.

Введение. Возбудитель новой коронавирусной инфекции (COVID-19) SARS-CoV-2 получил широкое распространение в мире, став причиной пандемии, которая началась в 2019 г. Вирус является зооантропонозным инфекционным агентом, вызывает инфекцию как у человека, так и у многих видов млекопитающих. К настоящему времени имеются сообщения о выявлении SARS-CoV-2 у домашних животных, а также у представителей дикой фауны. Кроме того, проведены исследования по успешному экспериментальному заражению некоторых видов животных. Имеются также доказательства того, что инфицированные особи могут передавать вирус другим животным в естественных условиях при контакте, в том числе между разными видами. В настоящее время ряд исследователей опасается, что SARS-CoV-2 распространится на виды млекопитающих в дикой природе, которые станут природным резервуаром, что может быть причиной вспышек инфекции в популяции людей. При этом воздействие вируса на потенциально восприимчивые виды животных дикой природы, в том числе исчезающие, в настоящее время до конца не изучено. В связи с этим необходимо проводить исследования по изучению распространения данной инфекции среди животных дикой фауны. Для этого требуются высокочувствительные и специфичные диагностические методы. Иммуноферментный анализ с применением в качестве антигена нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 может быть использован для серологического надзора за новой коронавирусной инфекцией среди животных. Применение в качестве антигена рекомбинантного белка является наиболее предпочтительным с точки зрения безопасности.

Цель исследования. Получение рекомбинантного нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 в высокой концентрации и проверка его антигенной активности и специфичности. Материалы и методы. В работе использовали: SARS-CoV-2, плазмиду pQE, штамм Escherichia coli JM109; осуществляли обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию, молекулярное клонирование, синтез рекомбинантного белка, очистку рекомбинантного белка, применяли непрямой вариант иммуноферментного анализа.

Результаты. Выполнено молекулярное клонирование N-гена SARS-CoV-2 с использованием прокариотической системы экспрессии. Получены клоны Escherichia coli, продуцирующие рекомбинантный нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2 размером 33 кДа. Определены оптимальные условия экспрессии и очистки, обеспечивающие получение препарата антигена в высокой концентрации. Показано, что оптимальной концентрацией индуктора является 0,5 мМ, оптимальный период экспрессии – 4 ч. В результате исследования оптимальных условий очистки рекомбинантного антигена в качестве денатурирующего агента определена мочевина в концентрации 8 М, подобрана оптимальная концентрация имидазола – 0,4 М в элюирующем буфере. Использование оптимальной схемы экспрессии и очистки позволило получить 1,5 мг очищенного антигена с 100 мл культуры Escherichia coli. Показана высокая антигенная активность и специфичность рекомбинантного белка в непрямом варианте иммуноферментного анализа.

Заключение. Получение рекомбинантного нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2 в высокой концентрации позволит в перспективе использовать его в качестве антигена при разработке иммуноферментной тест-системы для выявления антител к нуклеокапсидному белку SARS-CoV-2 в сыворотках крови животных.

Введение. Бруцеллез остается одной из наиболее распространенных инфекций в группе особо опасных зоонозов. Устойчивость к патогенным микроорганизмам рода Brucella зависит от полноценного клеточно-опосредованного иммунитета, включающего в себя активацию бактерицидных механизмов фагоцитов. Несмотря на неоднократно доказанную роль нейтрофилов в борьбе со многими бактериальными патогенами, функции этих иммунокомпетентных клеток при бруцеллезе оставались неизученными в течение продолжительного времени.

Цель исследования. Изучение функционально-метаболической активности нейтрофилов у молодняка крупного рогатого скота, сенсибилизированного неагглютиногенным штаммом бруцелл. Материалы и методы. У молодняка крупного рогатого скота, иммунизированного против бруцеллеза вакциной из неагглютиногенного штамма Brucella abortus RB-51, оценивали функционально-метаболическое состояние нейтрофилов на 7, 14, 21, 28, 35-е сут после иммунизации в тесте с нитросиним тетразолием, а также по уровню ферментной активности миелопероксидазы и содержанию неферментных катионных белков. Измерения показателей проводили фотометрическим способом в спонтанном и стимулированном вариантах постановки с последующим расчетом коэффициентов стимуляции. В качестве стимуляторов реакции применяли дезинтеграты бруцелл и корпускулярные антигены, изготовленные из вакцинных штаммов бруцелл с разной антигенной структурой.

Результаты. Было установлено, что при иммунизации молодняка крупного рогатого скота неагглютиногенным штаммом бруцелл функционально-метаболический статус нейтрофилов характеризуется усилением активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием на 7-е и 35-е сут исследования, отсутствием выраженных изменений в показателях ферментной активности миелопероксидазы, а также снижением количества неферментных катионных белков на 7–14-е сут после вакцинации.

Заключение. Наиболее выраженное увеличение коэффициентов стимуляции отмечается при применении в качестве стимулятора реакции дезинтегратов бруцелл. При оценке кислородзависимого метаболизма нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием максимальные значения коэффициентов стимуляции отмечали на 28-е сут после вакцинации, при оценке кислороднезависимого метаболизма – на 14-е сут.

Введение. Респираторный микоплазмоз и инфекционный синовит птиц являются экономически значимыми и нотифицируемыми болезнями, поэтому вопрос борьбы с Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae на птицеводческих предприятиях является актуальным. Применение вакцин – один из способов специфической профилактики, однако при разработке препаратов особое внимание уделяется оценке их протективных свойств. Контрольное заражение не всегда приводит к проявлению болезни ввиду ее преимущественно хронического течения и факторности.

Цель исследования. Воссоздание факторов, способствующих проявлению болезни в лабораторных условиях, и выявление патологических изменений в организме зараженных и иммунизированных птиц на гистологическом уровне. Материалы и методы. В качестве подопытных животных были отобраны серонегативные и вакцинированные куры кросса Хайсекс белый в возрасте 67 сут. В ходе опыта использовали штамм S6 Mycoplasma gallisepticum, штамм WVU 1853 Mycoplasma synoviae и штамм А/chicken/Amursky/03/12/Н9N2 вируса низкопатогенного гриппа птиц.

Результаты. Ассоциированное течение микоплазмозов с низкопатогенным гриппом птиц проявляется заболеванием и патогистологическими изменениями, среди которых легкие респираторные расстройства и суставной синдром. При гистологическом исследовании у зараженных невакцинированных птиц выявили нарушение целостности реснитчатого эпителия трахеи с очагами десквамации. У вакцинированной против микоплазмоза и экспериментально инфицированной птицы признаков отслаивания эпителия не наблюдалось, однако выявляли локальный отек подслизистого слоя трахеи. В железе третьего века у невакцинированных птиц, зараженных вирусом низкопатогенного гриппа птиц Н9N2, Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae, отмечали дистрофические изменения и инфильтрацию лимфоцитами, что свидетельствовало о наличии воспаления. В группе как вакцинированных, так и невакцинированных экспериментально инфицированных птиц в тканях легких выявляли лимфоцитарную инфильтрацию. Во всех группах птиц, кроме контрольной, наблюдали картину депопуляции лимфоцитов в корковом веществе фабрициевой сумки.

Заключение. Результатом данного исследования является создание метода проведения контрольного заражения птиц Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae, а также выявление условий для клинического проявления микоплазмозов, установление патологических изменений на клеточном уровне вследствие инфицирования.

Введение. Вакцинопрофилактика высокопатогенного гриппа птиц является надежным способом борьбы с болезнью. Среди антигриппозных вакцин наиболее широкое распространение имеют инактивированные цельновирионные препараты. Изучение иммуногенной активности вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» против актуальных вирусов высокопатогенного гриппа птиц является важной задачей.

Цель исследования. Оценка иммуногенной активности инактивированной вакцины «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» против актуального для России в 2023 г. высокопатогенного вируса гриппа птиц подтипа H5N1. Материалы и методы. Для испытаний готовили 4 вакцинных образца, содержащих цельный и разведенный 1/25, 1/50 и 1/100 антиген вируса гриппа птиц Н5 в прививном объеме. Каждым препаратом была привита отдельная группа птиц 4-недельного возраста. Через 28 сут куры были заражены вирусом гриппа птиц A/gull/Kirov/998-1/2023 H5N1, который был выделен во время вспышки заболевания на территории Российской Федерации и филогенетически определен как высокопатогенный возбудитель, принадлежащий к азиатской генетической линии вируса высокопатогенного гриппа птиц подтипа H5 (клада 2.3.4.4b). В группах зараженных птиц в течение 6 дней регистрировали погибших и больных особей.

Результаты. Установили, что птицы, привитые цельной дозой антигена, были полностью защищены от клинического проявления болезни после контрольного заражения. Уменьшение концентрации антигена в прививном объеме обусловило снижение протективной защиты вакцины. Показатель смертности после заражения контрольных (интактных) цыплят составил 10/10. Анализ зависимости протективной активности вакцины от величины иммунизирующей дозы антигена показал, что одна прививная доза содержала 97 ПД50. Исследование связи протективной защиты и напряженности поствакцинального гуморального иммунитета позволило определить, что ожидаемый среднегрупповой титр антител, который соответствует защите 90% вакцинированных птиц, составил 5,7 log2, или ≈ 1:52.

Заключение. Вакцина «ВНИИЗЖ-АвиФлуВак» обладает высокой иммуногенной активностью против актуального для России в 2023 г. вируса высокопатогенного гриппа птиц подтипа H5N1.

Введение. Высокопатогенный грипп птиц является особо опасной высококонтагиозной вирусной инфекцией домашних и диких птиц, в последние годы получившей широкое распространение на территории стран Европы, Азии, Африки и Америки. Возбудитель заболевания – вирус гриппа типа А подтипов H5 и H7. Одним из наиболее быстрых и эффективных способов идентификации и типирования вируса гриппа птиц является ОТ-ПЦР в режиме реального времени, в связи с чем представляется актуальной разработка тест-системы на основе данного метода с использованием внутреннего контрольного образца для возможности контроля основных этапов проведения реакции. При этом постановка реакции в мультиплексном формате позволяет одновременно идентифицировать несколько целевых мишеней, что уменьшает расход реагентов и время постановки реакции.

Цель исследования. Разработка тест-системы для выявления в пробах биологического материала РНК вируса гриппа птиц подтипов H5 и H7 методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени и определение ее основных характеристик. Материалы и методы. Использовали изоляты вируса гриппа птиц подтипов H5, H7, H3, H4, H10, H16, вирусы ньюкаслской болезни, инфекционной бурсальной болезни, инфекционного бронхита кур, болезни Марека и аденовирус птиц. В качестве внутреннего контрольного образца служил бактериофаг MS2.

Результаты. Подобраны оптимальные сочетания систем праймеров и зондов, определены характеристики тест-системы: специфичность в отношении гомологичных и гетерологичных вирусов болезней птиц, аналитическая чувствительность, эффективность реакции амплификации, повторяемость и воспроизводимость.

Заключение. При определении валидационных характеристик разработанной тест-системы установлена ее специфичность в отношении только вируса гриппа птиц подтипов H5 и H7, аналитическая чувствительность для каждого подтипа составила 1,5 lg ЭИД50/см3, эффективность амплификации – 92 и 97% соответственно. Проведена апробация тест-системы при исследовании поступающих в лабораторию проб биологического материала, результаты соответствовали таковым для стандартных диагностических методов, используемых в референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ».