Актуальность использования рыбного жира из отходов рыбопереработки обусловлена масштабностью проблемы, высокой биологической ценностью жира и его низкой хранимоспособностью. Целью исследования являлась оптимизация ферментативной экстракции жира из жиросодержащих рыбных отходов для микробного синтеза продуктов биотехнологии. В качестве сырья использовали головы копченой кильки и скумбрии, внутренности судака с содержанием жира 20,3–42,1 %. Планирование экспериментов осуществляли на основе ортогонального центрального композиционного плана второго порядка для трех факторов (температура, продолжительность, дозировка фермента алкалазы). Частными откликами являлись выход жира, его кислотное и перекисное числа. Установлено, что с увеличением дозировки фермента и продолжительности обработки выход жира увеличивается, а показатели качества ухудшаются. Количество извлекаемого жира варьируется от 24,9 % до 42,1 % от его содержания в сырье, кислотное число (мг КОН/г) изменяется от 5,7 (килька) до 21,7 (скумбрия), перекисное число (ммоль акт. кислорода/кг жира) — от 9,1 (килька) до 107,2 (скумбрия). Получены математические модели в кодированном и натуральном виде, связывающие факторы ферментолиза с частными откликами и обобщенным параметром оптимизации. Проанализированы изменения показателей качества и выхода жира в зависимости от каждого из факторов и их совокупностей, определены области локализации экстремумов поверхностей откликов. Рекомендуемые режимы ферментолиза, в зависимости от вида рыбного сырья: температура 45–65 °C; продолжительность 25–65 мин; дозировка алкалазы 0,35–0,45 %. Выделенный жир по своим показателям может быть использован в качестве источника углерода для микробного синтеза продуктов биотехнологии — белков и биополимеров полигидроксиалканоатов.