Статья: Моделирование бруцеллеза у мышей в условиях лаборатории уровня биологической безопасности 2 (2025)

Представлены данные о результатах сборки полных геномов двух клинических штаммов Klebsiella pneumoniae сиквенс-типа ST395, выделенных в 2021–2022 гг. в лечебных учреждениях Республики Беларусь.

Мембранный иммунохроматографический анализ (ИХА) с наночастицами золота в качестве репортеров сигнала является востребованным инструментом экспресс-диагностики ряда возбудителей инфекционных заболеваний, в т. ч. и холеры (Vibrio cholerae). Во ФБУН ГНЦ ПМБ разработан первый отечественный иммунохроматографический тест (ИХТ) для выявления патогенных вибрионов после обогащения образцов через культивирование в питательной среде.

Проводятся его испытания с целью последующей госрегистрации. Проведена апробация разработанного ИХТ – «Тест-полоска V. cholerae O1 Tox+» для прямого обнаружения холерных вибрионов в клинических образцах, собранных в Республике. Показана возможность прямого обнаружения антигена и токсина V. cholerae в образцах стула пациентов с диарейным синдромом с помощью ИХТ «Тест-полоска V. cholerae O1 Tox+». При исследовании 73 образцов стула в ИХА и полимеразной цепной реакции (ПЦР) чувствительность теста относительно ПЦР составила 100% по О1 антигену и 73% по ИХТ, специфичность – 100%.

Белок G широко используется в таких областях, как биохимия (изучение механизмов клеточного ответа на внешние стимулы, включая гормоны, нейромедиаторы и абиотические факторы), фармацевтика (разработка лекарств, модулирующих активность G-белков, для лечения сердечной недостаточности, воспалений и лейкоза), биотехнологии (выделение и очистка иммуноглобулинов из образцов, иммобилизация антител на поверхности). Наличие производства отечественного белка G актуально для развития в стране in vitro диагностики.

Патогены группы ESKAPE являются возбудителями многочисленных нозологий и одной из причин смерти от антибиотикорезистентных микроорганизмов. Наиболее тяжелое клиническое течение инфекций отмечается, когда возбудители находятся в ассоциациях и в организме присутствует сразу несколько патогенов. Микробные ассоциации могут основываться как на антагонизме, так и на синергизме, что, в свою очередь, может усиливать вирулентность участников тандема. Данный обзор посвящен изучению спектра популярных ассоциантов для ESKAPE-патогенов и их влиянию на вирулентность возбудителей внутри ассоциации.

С начала пандемии новой коронавирусной инфекции (COVID19), объявленной Всемирной организацией здравоохранения 11 марта 2020 г., прошло более пяти лет. За этот период накопился значительный массив знаний о динамике распространения вируса SARS-CoV-2 и о его эпидемиологических проявлениях. Определены источник возбудителя инфекции, механизм и пути заражения. В результате активных исследований разработаны вируснейтрализующие препараты. Вместе с тем на протяжении пандемии появились новые варианты вируса SARS-CoV-2, содержащие многочисленные мутации в субъединице S1 шиповидного белка, что привело к снижению эффективности многих одобренных вакцин и терапевтических средств на основе моноклональных антител. В связи с этим возникла острая потребность в идентификации новых мишеней для разработки вакцин и препаратов следующего поколения с широким спектром действия, способных эффективно противодействовать всем известным вариантам вируса SARS-CoV-2. В настоящем обзоре представлен анализ перспективных мишеней в субъединице S2 шиповидного белка SARS-CoV-2.

Обзорная статья посвящена одним из самых известных, хорошо изученных, но при этом остающихся одними из самых опасных для человека микроорганизмов - бактериям рода Staphylococcus. В статье рассмотрены современные сведения о таксономии, эволюции, морфологии, биохимии, генетике данного микроорганизма. Наибольшее внимание уделено развитию и прогрессированию устойчивости стафилококков к антимикробным средствам, в т. ч. в форме биопленок. Отмечено, что стафилококки обладают пластичной клеточной и генетической системой, позволяющей бактериям проявлять максимальное число адаптивных способностей к выживаемости и расширению своего влияния на инфекционную заболеваемость человека и животных. При этом показано, что исследование и обнаружение этих систем и молекулярно-генетических комплексов дают возможность формирования лекарственных и защитных средств от широкого круга стафилококковых инфекций. Ключевую роль в этих процессах играют такие системы, как система оперонов agr, двухкомпонентная система генов ArlRS, кластер генов ica, сигма-фактор sigB, кассетная хромосома стафилококка mec (SCC-mec), ферменты и токсины бактерий, их клеточная стенка. Эти системы рассматриваются исследователями в качестве мишеней терапевтического воздействия. В последние годы в связи с неэффективностью монотерапии антибиотиками стафилококковых инфекций сформировалась тенденция к поиску альтернативных препаратов на основе комбинаций антибиотиков, усиленных биофлавоноидами, алкалоидами, противоопухолевыми и противовирусными веществами, а также световым излучением.

В обзорной статье представлена информация о серологических методах диагностики бруцеллеза у людей, а также отражены недостатки и преимущества этих методов, составлен обзор препаратов для диагностики. Описана история появления и совершенствования классических методов и представлена информация о новых серологических методах диагностики бруцеллеза.

В статье рассматривается технологические подходы, применяемые к изготовлению и хранению основных иммунореактивных компонентов медицинского изделия «Тест-система дот-иммуноферментная для детекции туляремийного микроба моноклональная (ДИАТул-М)», которые обеспечили длительную стабильность готовых реагентов и сырьевых материалов. По результатам работы установлено, что высушивание моноклонального пероксидазного конъюгата с добавлением сахарозы обеспечивает сохранение его специфической активности до 10 лет при строгом соблюдении заданных условий хранения. Хранение моноклональных антител без существенной потери активности возможно в замороженном и высушенном виде с сахарозой в течение 5 лет.

Pseudomonas aeruginosa является одним из самых распространенных и прогностически сложных видов бактерий, выделяемых из респираторных образцов от пациентов с муковисцидозом (МВ). Синегнойная палочка представляет собой один из самых неуязвимых и резистентных к стандартным схемам терапии видов, особенно у пациентов на фоне длительной колонизации. Появление на российском рынке препаратов таргетной терапии стало большим прорывом в лечении МВ. Ввиду этого вопрос о возможности эрадикации P. aeruginosa из респираторного тракта пациентов с МВ на фоне терапии является актуальным для врачей различных специальностей. Проведено изучение биологических свойств 25 изолятов, выделенных из респираторных образцов 9 пациентов с МВ Самарской области, получающих патогенетическую терапию. У всех штаммов проведено изучение их культуральных свойств. Для всех штаммов проведено определение чувствительности к антибактериальным препаратам, бактериофагам, а также сняты белковые спектры методом экстракции с муравьиной кислотой, на основании которых построены CCI-матрицы для анализа степени родства между клонами и динамической оценки их протеомных характеристик. Серия наблюдений демонстрирует, что популяция штаммов характеризуется значительной гетерогенностью. Морфологически идентичные изоляты, полученные от пациентов в разные сроки наблюдения, сходны белковыми профилями и чувствительностью к бактериофагам. Однако уровень чувствительности к антибактериальным препаратам не коррелировал с протеомными и морфологическими характеристиками. Таким образом, проведение теста на определение чувствительности к бактериофагам может быть дополнительным критерием для оценки степени гетерогенности сформированного бактериального сообщества.

Представлены результаты изучения иммунологической активности in vivo субъединичного белка RibH1 Brucella abortus. Исследования показали, что однократное внутримышечное введение биомоделям 100 мкг субъединичного антигена RibH1 вызывает выраженную иммунологическую реакцию, которая проявляется активизацией лимфоцитопоэза с поляризацией в сторону пролиферации Т-клеток, активацией выработки цитокина интерлейкин-2, усилением метаболической активности (бактерицидного потенциала) фагоцитов. На ранних сроках после иммунизации RibH1 у экспериментальных животных отмечается формирование пула Т-лимфоцитов, реактивных в отношении исследуемого антигена бруцелл, что указывает на развитие адаптивных иммунологических реакций и может способствовать формированию активного Т-клеточного иммунитета против бруцеллезной инфекции. Таким образом, показана перспектива использования антигена RibH1 B. abortus в качестве компонента субъединичной вакцины против бруцеллеза.

Цель исследования – экспериментально обосновать возможность оптимизации стадии формоловой детоксикации безмикробного центрифугата штаммов Vibrio cholerae 569В и V. cholerae М-41 при производстве холерной химической вакцины. В качестве изменяемых факторов воздействия на процесс детоксикации были выбраны ее длительность и температура, при которой идет процесс. После окончания детоксикации проводили контроль специфической активности и специфической безопасности компонентов вакцины – холероген-анатоксина и О-антигенов. Показатели специфической активности (в реципрокных титрах) в дот-иммуноанализе составляли не менее 8 для холероген-анатоксина, 32 – для О-антигена Инаба, 160 – для О-антигена Огава, что соответствовало нормативной документации.

Исследование компонентов по показателю «Специфическая безопасность» выявило, что сокращение длительности детоксикации до 14 суток и увеличение температуры до 24 ± 2°C привело к неполной детоксикации безмикробного центрифугата штамма V. cholerae 569В.

Из полученных компонентов вакцины были выбраны наиболее активные и специфически безопасные образцы, из них была приготовлена экспериментальная таблеточная смесь, которая была проверена на соответствие промышленному регламенту на производство по показателям «Формальдегид», «Специфическая безопасность», «Аномальная токсичность», «Специфическая активность», «Иммуногенность». Результаты свидетельствуют о полном соответствии изученных свойств приготовленной смеси промышленному регламенту. Полученные данные свидетельствуют о возможности сокращения стадии детоксикации у штамма V. cholerae М-41 на 50% и V. cholerae 569В на 30% при повышении температуры до 37°C и 21°C соответственно.

Исследования, направленные на поиск перспективных для диагностики туляремии антигенных комплексов, совершенствование на их основе имеющихся и конструирование новых диагностических препаратов, не утрачивают своей актуальности. При этом большие надежды возлагаются на поверхностные структуры бактериальных клеток (липополисахарид, белки наружной мембраны) туляремийного микроба.

Целью нашего исследования явилось экспериментальное обоснование возможности применения комплексных антигенов внешних мембран и секретируемых стресс-белков туляремийного микроба для разработки тест-системы для определения специфических антител.

Результаты и обсуждение. Использование комплексных антигенов внешних мембран туляремийного микроба в иммуноферментном анализе (ИФА) позволяет выявлять специфические антитела у вакцинированных людей до 1,5 лет и лабораторных животных до 1,5 мес. после вакцинации (срок наблюдения). При этом в сыворотке вакцинированных людей обнаруживаются специфические антитела класса G и M. Применение комплексных антигенов в иммуноблоттинге может использоваться в качестве подтверждающего теста при скрининге сывороток в ИФА. Полученные стрессбелки обладают более низкой связывающей активностью в ИФА, но позволяют выявлять специфические антитела у вакцинированных лабораторных животных в более ранние сроки.

Заключение. В проведенной работе был изучен диагностический потенциал комплексных антигенов и секретируемых стресс-белков Francisella tularensis. Показана возможность использования комплексных антигенов внешних мембран туляремийного микроба для разработки экспериментальной тест-системы для детекции противотуляремийных антител. Секретируемые стресс-белки могут быть полезны при конструировании тест-систем для ранней диагностики туляремии.

Разработана биотехнология получения трехвалентного коктейля бактериофагов (vB_CpsM_H, vB_CpsM_M1, vB_ CpsM_E3), нацеленного на клинические штаммы Corynebacterium pseudotuberculosis, вызывающие казеозный лимфаденит у овец и коз. После очистки методом осаждения полиэтиленгликолем и ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия у исследованных фагов были выявлены вариабельные кинетические параметры адсорбции (K0 = 1,64– 6,24·10-8 мл/мин) и латентные периоды (30–40 мин), а также выраженная литическая активность (минимальное ингибирующее разведение – 1:256). В моделях на мышах коктейль обеспечил 75%-ю выживаемость при низкой бактериальной нагрузке (6·104 КОЕ/мл), но при более высокой нагрузке патогена его эффективность снижалась. Безопасность подтверждена валидированными протоколами стерильности, уровнем эндотоксина ниже порога обнаружения (<0,015 ЕЭ/мл) и отсутствием аномальной токсичности (0% смертности). Данная биотехнологически оптимизированная форма демонстрирует значительный потенциал в качестве таргетного терапевтического средства против казеозного лимфаденита.

В этом исследовании личинки самок Ixodes persulcatus первого поколения исследовали на наличие Candidatus Rickettsia tarasevichiae молекулярно-биологическими и микроскопическим методами. У индивидуально исследованных голодных личинок риккетсии были обнаружены в 80% случаев, а у напитавшихся личинок количество клеток риккетсий снижается. На основании результатов исследований установлен высокий уровень трансовариальной передачи, который незначительно снижается после напитывания личинок.

Цель работы. Идентифицировать О-серогруппы уропатогенных штаммов Escherichia coli (УПЭК), выделенных из мочи пациентов с инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) на территории г. Саратова, и определить филогенетические группы и подгруппы, а также факторы патогенности и сиквенс-типы, характерные для различных О-серогрупп.

Материалы и методы. О-серогруппы, факторы патогенности, филогенетические группы и подгруппы для 102 штаммов УПЭК, выделенных из мочи пациентов с ИМП, определяли с использованием методов полимеразной цепной реакции и полногеномного секвенирования. С использованием результатов полногеномного секвенирования установлены сиквенс-типы для 36 штаммов УПЭК.

Результаты. Установлено, что 73 штамма УПЭК принадлежали к 17 различным серогруппам (О1, О2, О6, О7, О8, О15, О18, О25, О29, О45, О53, О75, О76, О83, О101, О109, О117). Наибольшая частота встречаемости определена для серогрупп О25 (32,4%), О2 (8,8%), О1 (5,9%), О6 (4,9%), О101 (3,9%). При этом для серогрупп О25, О2, О1, О6, О101 наиболее характерными были гены fimH, iha, opmT, kpsMT, iron, iuc, irp2, usp, кодирующие факторы патогенности. Гены sfa, hlyA, astA были характерны для штаммов, принадлежащих к серогруппам О2, О6, О25. При определении принадлежности идентифицированных серогрупп штаммов УПЭК к филогенетическим группам и подгруппам было выявлено, что серогруппы О6 и О25 принадлежали к B23, серогруппа О101 – к А1, серогруппа О1 – к А1, В23 и D1, тогда как серогруппа О2 – к B23 и D2. В данной работе также установлены 16 ранее известных сиквенс-типов: ST131, ST10, ST141, ST59, ST69, ST73, ST95, ST127, ST1057, ST117, ST162, ST167, ST416, ST533, ST744, ST12013, а также один неизвестный – ST15134.

Заключение. Штаммы УПЭК, выделенные на территории г. Саратова, в большинстве случаев принадлежали к серогруппам О1, О2, О6, О25 и О101 и характеризовались наличием различных факторов патогенности и принадлежностью к различным филогенетическим группам и подгруппам.

Francisella tularensis – этиологический агент туляремии, инфекционного заболевания человека, грызунов и зайцеообразных. F. tularensis включает четыре подвида (tularensis, holarctica, mediasiatica и novicida), которые различаются по своей патогенности и приуроченности к ландшафтно-географическим зонам. Несмотря на различия, штаммы F. tularensis проявляют очень ограниченное генетическое разнообразие, что затрудняло разработку полезных инструментов для изучения эпидемиологии патогена. Одним из первых инструментов дифференциации штаммов возбудителя туляремии стал метод VNTR. В дальнейшем развитие методов полногеномного секвенирования (WGS) способствовало созданию методов типирования бактерий с помощью анализа геномных SNP (single nucleotide polymorphism). В настоящее время для генотипирования микроорганизмов все чаще применяются иерархические методы дифференциации, основанные на MLVA и SNP-анализе. Целью исследования является статистический анализ корреляции результатов MLVA и SNP-типирования для выявления генетического разнообразия штаммов двух подвидов – F. tularensis subsp. holarctica и mediasiatica. Сравнительный анализ UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean) дендрограмм методом танглеграмм позволил оценить согласованность кластеризации данных, полученных при разных способах генотипирования 31 штамма подвида holarctica. Коэффициент корреляции (BGI) составил 0,76, что означает сильную корреляцию разных методов кластеризации. Для 59 штаммов подвида mediasiatica BGI оказался равен 0,89 и приближен к показателю очень сильной корреляции. Корреляция согласованности кластеризации генотипов для обоих методов находится в пределах от сильной до очень сильной, что дает возможность их использования в иерархической схеме генотипирования штаммов F. tularensis двух изученных подвидов. Метод танглеграмм впервые применен для сравнительной оценки результатов генотипирования выборки штаммов возбудителя туляремии двух подвидов (holarctica и mediasiatica) методами MLVA и SNP-типирования.

Проведенное исследование посвящено оценке антимикробной активности пяти комплексных препаратов фитонцидов против планктонных культур и биопленок патогенных микроорганизмов, включая референс-штаммы и клинические изоляты. Антимикробную активность препаратов оценивали методом серийных разведений для определения минимальных бактерицидных концентраций. Была продемонстрирована высокая активность препаратов против грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, грамотрицательных бактерий Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa, а также против патогенных грибов Candida albicans и Candida auris. Полученные результаты обосновывают целесообразность дальнейших исследований, направленных на детальное изучение механизмов антимикробного действия фитопрепаратов, а также использование данных препаратов в комплексных профилактических мероприятиях.

В данном исследовании проанализированы материалы сбора клещей лесного Ixodes ricinus, лугового Dermacentor reticulatus в природных биотопах Тульской области и их инфицированность возбудителями иксодовых клещевых боррелиозов (ИКБ) за период с 2010 по 2020 г. Наибольшее количество клещей I. ricinus собрано в Алексинском, Ленинском и Суворовском районах, расположенных в лесной зоне области. Инфицированность клещей бактериями варьировала и по районам, и по годам в среднем от 5,38 до 36,95%. Всего исследовано на наличие возбудителей ИКБ 75,5% экземпляров клещей от общего количества, собранных в этот период (4736 из 6272 экземпляров). По результатам исследования собранных образцов I. ricinus ДНК бактерий рода Borrelia обнаружена в 754 пробах. Типировано 213 проб. В 188 (88,26%) пробах выявлена ДНК бактерий B. afzelii, в 25 пробах (11,74%) – ДНК бактерий B. garinii 20047Т. Доминирующий в области геновид B. afzelii преобладал в природных биотопах западной и центральной части лесной зоны (Белёвский, Суворовский, Ленинский районы). В северо-западной части лесной зоны (Алексинский район) и юго-восточной части лесостепной зоны (Ефремовский район) инфицированность клещей геновидами B. afzelii и B. garinii была одинаковой. В Венёвском районе инфицированных клещей не обнаружено.

При исследовании 3297 образцов клещей D. reticulatus ДНК бактерий рода Borrelia обнаружена в одной пробе в лесной зоне в Белёвском районе.

Полученные в ходе анализа данные подтверждают необходимость комплексного молекулярно-биологического мониторинга зараженности популяций клещей I. ricinus в природных очагах иксодовых клещевых боррелиозов Тульской области как определяющего фактора при расчете эпидемиологических рисков. Важно проводить информирование населения о рисках последствий присасывания клещей и мерах профилактики болезни Лайма (боррелиоза).

Ботулинический токсин – это один из наиболее опасных биологических токсинов, применяемый в медицине, однако несущий потенциальную опасность в качестве агента биологической угрозы. В данном исследовании проведен комплексный in silico анализ аминокислотной последовательности ботулинического токсина разных серотипов с целью идентификации уникальных пептидных маркеров для специфической детекции методами масс-спектрометрии. Проведение биоинформатического анализа и теоретического протеолиза позволило идентифицировать уникальные пептиды, покрывающие различные функциональные домены ботулинических токсинов. Предложенные маркеры демонстрируют полную специфичность к целевым серотипам ботулотоксинов при анализе в базах данных UniProt и NCBI. Отобранные уникальные пептидные маркеры могут быть использованы при проведении анализа биологических образцов, продуктов питания или объектов окружающей среды на наличие ботулотоксинов методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии в режиме множественного мониторинга реакций или методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией.

Стафилококковые энтеротоксины A (SEB) и B (SEB), секретируемые коагулазоположительными бактериями Staphylococcus aureus, – известные этиологические агенты пищевых токсикоинфекций человека. При их детекции в пищевых продуктах важно устранять негативное влияние пищевой матрицы на специфичность и чувствительность используемой тест-системы. Целью данного исследования являлась разработка методики с использованием иммуномагнитной сепарации и иммуноферментного анализа для детекции стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах. Для решения поставленной задачи были получены моноклональные антитела, специфично взаимодействующие с SEA и SEB, на основе которых получены иммуномагнитные частицы для сепарации и концентрирования токсинов, разработана сэндвич-иммуноферментная тест-система для детекции токсинов. В результате удалось достигнуть ~80%-й извлекаемости энетротоксинов после искусственной контаминации пищевых образцов с пределом детекции 10 нг на 100 г образца продукта.

Инфекции нижних дыхательных путей являются одной из наиболее частых причин смерти в мире. Они могут быть ассоциированы с широким спектром бактериальных, вирусных или грибковых патогенов. Одним из актуальных возбудителей пневмонии является Mycoplasmoides pneumoniae.

Применение наряду с традиционными методами диагностики новых комплексных подходов к анализу клинических образцов, таких как метагеномные исследования, позволяет изучать совокупность патогенов, проводить их генотипирование, устанавливать наличие факторов вирулентности и резистентности.

В данной работе исследованы 464 клинических образца, полученных от пациентов с микоплазменной пневмонией во время вспышки на территории Российской Федерации в период с ноября 2023 г. по февраль 2024 г. Наличие возбудителя M. pneumoniae подтверждено во всех образцах методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Большинство пациентов составляли дети (n = 449), медианный возраст – 12 лет, межквартильный размах – от 10 до 15 лет.

Метагеномный и филогенетический анализы позволили идентифицировать геновариант M. pneumoniae – сиквенстип ST3, относящийся к международному клональному комплексу CC1.

SNP-анализ собранных полных геномов изучаемых образцов M. pneumoniae не выявил мутаций a2063g и/или a2064g в последовательности гена 23S рРНК, наличие которых ассоциировано с устойчивостью патогена к макролидам. Таким образом, можно предположить, что микоплазмы, содержащиеся в образцах, чувствительны к макролидам.

В статье рассматривается комплекс исследований при создании лиофилизированной тест-системы для диагностики малярии на основе изотермической амплификации (LAMP). Малярия остается одним из наиболее распространенных и опасных заболеваний в мире, уносящим тысячи жизней. Традиционная диагностика (микроскопия, экспресс-тесты, полимеразная цепная реакция) надежна, но непрактична в регионах с ограниченными ресурсами для оказания медицинской помощи. Разработка лиофильно высушенных LAMP-тестов, стабильных при хранении и транспортировке без использования холодовой цепи, – перспективная альтернатива для быстрой и высокоэффективной диагностики малярийного плазмодия. Разработанная нами тест-система в лиофильно высушенном формате для выявления малярии поможет улучшить диагностику и лечение малярии, особенно в регионах с ограниченным доступом к медицинской помощи.