В статье представлены результаты исследования технологических особенностей живописи одного из значимых, но малоизученных иконописных ансамблей конца XVI в. — центрального иконостаса Смоленского собора Новодевичьего монастыря. В ходе работы был проанализирован химический состав образцов грунта и красочного слоя авторской и поновительской живописи двадцати пяти икон. Из них 19 икон относятся к праотеческому, пророческому, деисусному и праздничному рядам и являются единым комплексом; пять икон — из местного ряда, который состоит из разновременных произведений древнерусской иконописи, имеющих свои технологические особенности. Впервые была исследована икона «Тайная вечеря» с навершия царских врат, для которой удалось уточнить время создания, а также технику живописи. Анализ материалов живописи проводился с использованием комплекса физико-химических и оптических методов, таких как поляризационная микроскопия, энергодисперсионный рентгеновский микроанализ, инфракрасная микроспектроскопия, микроспектроскопия комбинационного рассеяния, рентгенофлуоресцентный анализ и микрохимический анализ. Изготовление микрошлифов позволило исследовать послойную структуру красочных слоев. В результате исследования были получены сведения о технологических особенностях живописи икон разного времени, о пигментном составе авторских красочных слоев и слоев поновлений, сохранившихся на некоторых участках, а также выявлены причины изменения колорита ряда икон.