Публикации автора

Сочетание широкого использования антибиотиков и присутствия в кормах остаточных количеств пестицидов способно поставить под угрозу терапевтические и производственные эффекты от применения антибактериальных препаратов в промышленном птицеводстве. Происходящие при этом изменения могут сопровождаться модификацией экспрессии ряда генов. В настоящей работе впервые показано, что стимуляция мясной продуктивности цыплят-бройлеров кросса Ross 308 под влиянием ветеринарных антибиотиков энрофлоксацина и колистина, вероятно, имеет связь с индукцией экспрессии гена MYOG, который способствует развитию и дифференцировке мышц, генов антимикробной ( Gal9, Gal10 ) и антивирусной ( IRF7 ) защиты, а также провоспалительных генов IL6, IL8 и PTGS2. Кроме того, впервые выявлено, что глифосат подавляет экспрессию антимикробных и антивирусных генов у цыплят-бройлеров. Наша цель заключалась в оценке продуктивности и изменения экспрессии генов, ассоциированных с иммунитетом, продуктивностью и устойчивостью к токсическим и лекарственным веществам, при воздействии антибиотиков, в том числе на фоне загрязнения кормов глифосатом и введения в рацион цыплят-бройлеров штамма Bacillus sp. Эксперименты проводили в 2022 году в виварии ООО «БИОТРОФ+» на бройлерах ( Gallus gallus L.) кросса Ross 308 от 1- до 35-суточного возраста. Для кормления с 1-х по 28-е сут использовали комбикорм ПК 5 для бройлеров, с 29-х по 35-е сут - ПК 6 для бройлеров. Птицу разделили на 4 группы по 40 гол. в каждой. Бройлеры в I группе (контроль) получали рацион без антибиотиков, глифосата и штамма микроорганизма; во II опытной - рацион с добавлением ветеринарных антибиотиков энрофлоксацина и колистина в виде препарата Энрофлон К (ООО «ВИК - здоровье животных», Россия) в дозировке 1 мл/л воды с 1-х по 5-е сут выращивания и флорфеникола (ООО «Агроветзащита С.-П. НВЦ», Россия) в дозировке 1 мл/л воды с 17-х по 20-е сут; в III опытной - рацион с добавлением препарата Энрофлон К по схеме, описанной выше, а также глифосата в составе препарата Агрокиллер (ЗАО Фирма «Август», Россия) в количестве 20 мг/кг корма, что соответствовало 1ПДК для продуктов питания; в IV опытной - рацион с добавлением энрофлоксацина, колистина, флорфеникола, глифосата, а также штамма Bacillus sp. ГЛ-8, выделенного из кишечника бройлеров. Для анализа содержания глифосатов методом ИФА в кормах и питательных средах использовали cтриповый иммуноферментный анализатор STAT FAX 303+ («Awareness Technology Co. LLC», США) и тест-систему Glyphosate ELISA, Microtiter Plate («Abraxis», США). В конце эксперимента у бройлеров отбирали ткани слепых отростков кишечника и грудных мышц. Анализ экспрессии генов проводили с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией. Тотальную РНК выделяли с использованием мини-набора AurumТМ Total RNA («Bio-Rad», США), следуя инструкциям производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили для получения кДНК на матрице РНК с использованием iScriptТМ Reverse Transcription Supermix («Bio-Rad», США). Для анализа экспрессии мРНК были выбраны специфические праймеры для генов интерлейкина 6 ( IL6 ), интерлейкина 8 ( IL8 ), синтеза регуляторного фактора интерферона 7 ( IRF7 ), простагландин-эндопероксидсинтазы ( PTGS2 ), синтеза b-дефензина 9 AvBD9 ( Gal9 ), b-дефензина 10 AvBD10 ( Gal10 ), инсулиноподобного фактора роста 1 ( LGF1 ), миогенина ( MYOG ), миозенина ( MYOZ2 ) и гена GSTA3, связанного с устойчивостью к токсическим и лекарственным веществам. ПЦР проводили с использованием амплификатора ДТлайт («ДНК-Технология», Россия) и набора SsoAdvancedТМ Universal SYBR® Green Supermix («Bio-Rad», США). Живую массу бройлеров определяли в возрасте 7, 14, 21, 28 и 35 сут. Показано, что антибиотики стимулировали (p £ 0,05) продуктивность бройлеров с 14-х сут жизни до конца эксперимента на 4,8-23,3 % (II группа по сравнению с I группой). В конце эксперимента отмечали негативное влияние глифосата на продуктивность бройлеров (III группа по сравнению со II, p £ 0,05). Результаты оценки экспрессии генов бройлеров, связанных с ростом и формированием мышечных волокон, показали, что экспрессия гена MYOG была выше у бройлеров из II и IV групп соответственно в 2,0 и 2,1 раза по сравнению с I группой (p £ 0,05). В III группе количество мРНК гена MYOG не повышалось (р > 0,05), что свидетельствует о негативном влиянии глифосата на экспрессию генов продуктивности птицы. Глифосат (III группа) выступал и как супрессор экспрессии генов антимикробной и антивирусной защиты Gal9, Gal10 и IRF7 (по сравнению со II группой) (p £ 0,05). Интродукция штамма микроорганизма в корм на фоне глифосата и антибиотиков (IV группа) вызывала усиление экспрессии Gal9 по сравнению с наблюдаемой в III группе (p £ 0,05). Прослеживалась тенденция резкого возрастания экспрессии провоспалительных генов IL6, IL8 и PTGS2 во II группе (соответственно в 4,6; 11,2 и 6,6 раза по сравнению с контролем, p £ 0,05). Введение в рацион антибиотиков также оказало некоторое стимулирующее воздействие на экспрессию гена GSTA3 (p £ 0,05). Таким образом, механизм положительного влияния антибиотиков на продуктивность бройлеров кросса Ross 308, вероятно, частично связан с тем, что антибиотики выступают в роли индукторов ряда важных генов. На фоне глифосатов эффект стимуляции продуктивности птицы снижался. Глифосаты оказывают воздействие, в том числе, через нарушение активности некоторых ключевых генов. Наблюдаемые позитивные изменения транскрипции ряда генов, включая гены антимикробной и антивирусной защиты, под влиянием штамма микроорганизма Bacillus sp., свидетельствуют о перспективности пробиотиков как инструмента сглаживания физиологического дисбаланса при применении лекарственных веществ и загрязнении корма токсическими веществами.

В современных условиях представляет интерес изучение эффективности натуральных комплексных кормовых добавок, которые позволят регулировать состав и метаболическую активность микробиома и улучшить иммунитет и физиологический статус кроликов. В настоящей работе впервые с применением биоинформатических методов обнаружено, что комплексный пробиотический биопрепарат оказывает влияние на изменение прогнозируемых метаболических путей в микробиоме кишечника кроликов. Целью работы было изучение совместного действия комплекса, содержащего минеральные вещества и пробиотик, на организм кроликов, их физиологические показатели, состав и функциональный потенциал микробиома. Исследование проводили в 2021 году на 10 кроликах породы советская шиншилла на базе вивария ФГБУ ВО СПХФУ Минздрава России. Возраст животных на начало эксперимента - 2,5 мес, живая масса - 5,37-5,53 кг. Животных разделили на две группы (по 5 гол. в каждой): I контрольная группа получала основной рацион (ОР) в соответствии с рекомендуемыми детализированными нормами РАСХН (2003 год), II опытная группа - ОР с добавлением комплексной кормовой добавки микроэлементов и пробиотического штамма бактерий в количестве 30 мг/гол. в сутки. Комплексная кормовая добавка включала микроэлементный препарат Silaccess (ООО «ТЕХНОЛОГ 2Д», Россия) в дозе 5 мг/кг живой массы. Кроме того, в добавку был включен пробиотический штамм микроорганизма Bacillus subtilis 1-85. На 30-е и 60-е сут после начала эксперимента животных взвешивали натощак перед утренним кормлением, а также брали кровь для анализа. Определяли естественную резистентность (бактерицидная активность, включая лизоцимную, фагоцитарная активность нейтрофилов). Образцы химуса слепых отростков кишечника для исследования микробиома отбирали в конце эксперимента с максимально возможным соблюдением условий асептики вручную и немедленно помещали в стерильные пластиковые пробирки. Тотальную ДНК выделяли с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Thermo Fisher Scientific, Inc.», США). Бактериальное сообщество оценивали методом NGS-секвенирования на автоматическом секвенаторе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с праймерами для V3-V4 региона гена 16S рРНК: 5´-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAG-AGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3´ (прямой праймер), 5´-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-TATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3´ (обратный праймер). Реконструкцию и прогнозирование функционального содержания метагенома проводили при помощи программного комплекса PICRUSt2 (v.2.3.0) (https://github. com/picrust/picrust2). Математическую и статистическую обработку результатов осуществляли методом многофакторного дисперсионного анализа в программах Microsoft Excel XP/2003, R-Studio (Version 1.1.453) (https://rstudio. com). Фагоцитарный индекс был выше (p ≤ 0,05) во II опытной группе по сравнению с контрольной на 1,8, фагоцитарное число - на 32,3 % (p ≤ 0,05). С применением метода NGS-секвенирования во II группе были установлены более высокие значения индексов a-биоразнообразия Chao1, Shannon и Simpson (p £ 0,05) по сравнению с I группой. По данным исследований таксономического состава микроорганизмов слепых отростков кишечника кроликов выявили 12 филумов царства Bacteria, среди которых представители филума Firmicutes доминировали по численности (80,2±6,2 % в контрольной группе, 78,2±7,4 % в опытной группе). Во II группе происходило количественное увеличение филумов Verrucomicrobiota, Actinobacteriota, Patescibacteria, Proteobacteria, Desulfobacterota в 1,3-2,6 раза и снижение представленности филума Campilobacterota в 4,8 раза (p ≤ 0,05). В слепых отростках кишечника у кроликов из опытной группы наблюдалось возрастание численности бактерий рода Bacillus spp. в 2,82 раза по сравнению с контролем (p ≤ 0,05). В кишечнике животных из I контрольной группы присутствовал вид Staphylococcus sciuri (0,075±0,006 %), тогда как во II опытной группе его не обнаружили. В результате анализа, проведенного с использованием программного комплекса PICRUSt2 (v.2.3.0), у микробного сообщества кишечника кроликов мы выявили 370 прогнозируемых метаболических путей, при этом между экспериментальными группами наблюдались различия (p ≤ 0,05) по 36 путям. В кишечном микробиоме животных из II опытной группы по сравнению с I контрольной происходила активация (p ≤ 0,05) путей, которые относились к деградации ароматических соединений и ксенобиотиков, белковому, углеводному, энергетическому обмену, биосинтезу спиртов, фотодыханию, ассимиляции формальдегида, деградации мио-, хиро- и сцилло-инозитола, синтезу клеточной стенки и спорообразованию. Доминирующее число (15 путей) усиленных потенциальных метаболических путей было связано с деградацией ароматических соединений и ксенобиотиков. Таким образом, введение в рацион кроликов породы советская шиншилла комплексной кормовой добавки на основе пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis 1-85 и микроэлементов оказывает множественное позитивное действие как на микроорганизмы (биологический контроль над патогенами, регуляция метаболических путей), так и на макроорганизм (повышение иммунитета, улучшение физиологии).