Введение. В настоящее время наблюдается широкое распространение и активная циркуляция Mycoplasma dispar в животноводческих хозяйствах по всему миру, в том числе и в Российской Федерации. Актуальность внедрения в ветеринарную практику тест-системы на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления ДНК Mycoplasma dispar обусловлена важной ролью данного возбудителя в развитии комплекса респираторных болезней крупного рогатого скота, приводящих к значительным экономическим потерям в животноводстве, в том числе являющихся причиной падежа телят.
Цель исследования. Определение основных валидационных характеристик и внедрение в ветеринарную практику разработанной тест-системы для выявления ДНК Mycoplasma dispar методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Материалы и методы. Референтный штамм Mycoplasma dispar (ATCC № 27140) культивировали на питательной среде 1699 Revised Mycoplasma Medium, рекомендованной American Type Culture Collection. ДНК выделяли с использованием коммерческого набора, постановка ПЦР в режиме реального времени осуществлялась по заранее подобранным параметрам. Были определены основные валидационные характеристики тест-системы: аналитическая чувствительность, аналитическая специфичность, эффективность амплификации, повторяемость и воспроизводимость. Показана возможность практического применения тест-системы на основе ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК Mycoplasma dispar.
Результаты. Аналитическая чувствительность (предел обнаружения) тест-системы по выявлению ДНК Mycoplasma dispar составила 10 копий ДНК/мкл (или 100 копий ДНК/реакцию), специфичность – 100% (детектирует только ДНК Mycoplasma dispar), эффективность амплификации – 99,01%, среднее значение коэффициента вариации при оценке повторяемости – 0,91%, воспроизводимости – 0,66–1,26% в рамках 5 повторений и 0,91% в рамках 15 повторений. Апробацию тест-системы проводили на 228 пробах биоматериала, отобранных от крупного рогатого скота из 13 регионов Российской Федерации, при этом ДНК Mycoplasma dispar была обнаружена в 39,47% исследуемых проб.
Заключение. Разработанная тест-система для выявления ДНК Mycoplasma dispar продемонстрировала высокие валидационные показатели и может быть использована в диагностике микоплазмоза крупного рогатого скота.
Введение. На достоверность результатов, получаемых при проведении ПЦР-диагностики, могут влиять такие факторы, как ошибки оператора, неполадки в работе амплификатора, наличие в образце ингибиторов реакции, низкое качество реактивов и другое. Все это может приводить к появлению так называемых ложноотрицательных результатов. Цель исследования. Разработка системы внутреннего контроля на основе гетерологичного вируса ньюкаслской болезни при детекции вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции.
Материалы и методы. В качестве внутреннего контрольного образца использовалась «Вакцина против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота» сухая живая» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Россия). РНК из образцов выделяли с помощью набора реагентов «РИБО-сорб» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия). Для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией использовали реактивы фирмы Promega (США) и олигонуклеотиды производства ООО «Синтол» (Россия).
Результаты. В качестве объекта для внутреннего контрольного образца выбран штамм «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни. Проведен дизайн праймеров. В серии экспериментов установлено, что ПЦР-система для внутреннего контрольного образца не конкурирует с ПЦР-системой для вируса бешенства при их совместном использовании. Оптимизированы основные параметры обратной транскрипции и полимеразной реакции. Проведена валидация разработанной методики, в ходе которой определялись такие характеристики, как правильность, специфичность, чувствительность, промежуточная прецизионность в условиях повторяемости (сходимость) и промежуточная прецизионность в условиях воспроизводимости (воспроизводимость). По результатам валидации полученные характеристики метода соответствуют требуемым.
Заключение. На основе штамма «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни разработана система внутреннего контрольного образца для использования совместно с методикой выявления вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, позволяющая контролировать ход всех этапов анализа в каждой реакционной пробирке. Данная система при надлежащей оптимизации потенциально может применяться также в экспериментальных научных исследованиях в соответствующих профильных научных организациях при ПЦР-диагностике заболеваний, вызываемых другими РНК-содержащими вирусами.