Несмотря на то, что число эмбрионов крупного рогатого скота (КРС), получаемых in vitro (in vitro embryo production, IVP), в мире ежегодно возрастает, их качество все еще уступает качеству эмбрионов, получаемых in vivo, а условия, в которых происходит развитие IVP эмбрионов, до сих пор требуют детализации. В связи с этим в представленной работе была изучена зависимость развития IVP эмбрионов и их качества от условий обновления среды in vitro культивирования (in vitro culture, IVC) и ее объема. Post mortem ооциты коров культивировали в среде созревания, оплодотворяли in vitro заморожено-оттаянной спермой и переносили в среду BO-IVC («IVF Bioscience», Великобритания) объемом 500 или 100 мкл для эмбрионального развития. Сравнивали три варианта инкубации: без смены среды (БСС), с полной сменой среды (ПСС) и с частичной сменой среды (ЧСС). В первом случае эмбрионы развивались в течение всего периода (8 сут) без обновления среды культивирования, во втором - через 3 сут IVC эмбрионы были перенесены для дальнейшего развития в капли свежей среды, в варианте ЧСС через 3 сут инкубации половина изначального объема среды удалялась и заменялась эквивалентным объемом свежей среды. Во всех вариантах на 8-е сут культивирования оценивали число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты (Бл), и их качество (на основе определения общего числа ядер и ядер с признаками апоптоза в Бл при цитологическом анализе). Также исследовали развитие 8-суточных бластоцист через 2 сут дополнительного культивирования до стадии вылупившейся Бл (ВБл). Результаты показали, что по сравнению с непрерывным культивированием ПСС обеспечивала значительное повышение частоты образования бластоцист (с 23,0±1,5 и 25,8±0,8 до 45,7±4,8 и 52,1±4,9 %, p < 0,01), снижение частоты апоптоза в эмбрионах (с 6,53±0,88 и 6,47±0,66 до 3,60±0,12 и 3,50±0,29 %, p < 0,05 и p < 0,01) и повышение выхода вылупившихся бластоцист от общего числа оплодотворенных ооцитов (с 14,9±1,5 и 11,6±3,3 до 25,2±3,9 и 40,8 ±3,2 %, p < 0,05 и p < 0,001) независимо от объема IVC среды, в котором происходило развитие эмбрионов (данные представлены для объема среды соответственно 500 и 100 мкл), а также увеличивало число ядер в Бл в случае культивирования эмбрионов в среде объемом 100 мкл (с 175,8±13,5 до 224,3±6,7, p < 0,05). Культивирование, предполагающее ЧСС, также было по основным показателям эффективнее, чем таковое без смены среды. Частота образования бластоцист (до 44,9±0,7 и 44,1±5,0 %, p < 0,01 и p < 0,01) и развития до стадии ВБл (до 26,2±3,2 и 27,7±1,4 %, p < 0,05) повышалась аналогично тому, что наблюдалось при ПСС, а в случае культивирования в среде объемом 100 мкл отмечалось увеличение числа ядер в Бл (до 230,4±8,4, p < 0,05) и снижение доли апоптотических ядер (до 3,10±0,17, p < 0,01). Значимых различий между вариантами ПСС и ЧСС по всему спектру исследуемых показателей обнаружено не было, тем не менее при ПСС и культивировании в среде объемом 100 мкл показатели развития Бл и ВБл оказались самыми высокими. Таким образом, ПСС и ЧСС в сравнении с культивированием без смены среды положительно влияют на развитие и качество IVP эмбрионов КРС. Также отмеченный эффект, очевидно, зависит от объема среды IVC. При культивировании эмбрионов в среде BO-IVC объемом 500 мкл эффективны оба способа обновления среды, для объема 100 мкл лучшие показатели достигаются при ПСС.
Прижизненное получение ооцитов (ovum pick-up, OPU) - важнейший элемент в системе получения эмбрионов коров in vitro (IVP). В этой связи повышение результативности OPU становится определяющим фактором для широкого внедрения IVP-технологии в разведение крупного рогатого скота. В представленной работе впервые показана возможность и эффективность получения OPU-ооцитов у коров ярославской породы. В ярославской породе по сравнению с симментальской установлена вариабельность числа фолликулов как между отдельными животными, так и между сессиями у одних и тех же животных. Мы не наблюдали статистически значимых различий в степени извлечения и качественных характеристиках ооцит-кумулюсных комплексов, что позволяет использовать стандартизированные протоколы для телок-доноров симментальской и ярославской пород. Целью настоящей работы было изучение влияния индивидуальных и породных особенностей телок-доноров симментальской и ярославской пород на результативность прижизненного получения ооцитов. Исследования проводили в ФИЦ ВИЖ им. Л. К. Эрнста в 2020-2022 годах на половозрелых клинически здоровых телках ( Bos taurus taurus ) симментальской и ярославской пород в возрасте от 17 до 36 мес. Ооциты получали методом трансвагинальной сонографически-ассистированной пункции фолликулов с интервалом между сессиями 7 сут в соответствии с методическими рекомендациями с использованием системы для OPU у крупного рогатого скота Bovine OPU («Minitube GmbH», Германия). В первом эксперименте изучали влияние на результативность OPU индивидуальных особенностей телок-доноров симментальской ( n = 7, 50 сессий) и ярославской ( n = 5, 25 сессий) пород. Во втором эксперименте оценивали результативность OPU в зависимости от породных особенностей телок-доноров симментальской ( n = 6, 12 сессий) и ярославской ( n = 5, 25 сессий) пород, используя параметры проведения OPU, оптимизированные для животных симментальской породы. Критериями оценки результативности OPU были число видимых с помощью УЗИ фолликулов, число извлеченных ооцитов в составе ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК), степень извлечения ОКК, доля ОКК, потенциально пригодных для использования в системе получения IVP эмбрионов, от общего количества извлеченных ОКК. Пригодными считали ОКК, у которых в ооцитах не было явных признаков аномалий цитоплазмы (дегенерация, лизис, сжатие, неправильная форма), за исключением созревших ОКК. Также к пригодным относили ооциты с гомогенной ооплазмой, лишенные полностью или частично клеток кумулюса. Мы наблюдали высокую вариабельность среднего числа УЗИ-видимых фолликулов между телками-донорами как симментальской (4,71-11,50 фолликулов; Cv = 47,9 %), так и ярославской пород (5,80-9,80 фолликулов, Cv = 32,0%), при этом различия между некоторыми донорами были высокодостоверны (p ≤ 0,001). Различия в числе УЗИ-видимых фолликулов приводили к различиям в числе получаемых ОКК между отельными донорами симментальской (2,33-5,17 ОКК) и ярославской пород (3,60-6,00 ОКК). Сравнительные исследования телок-доноров симментальской и ярославской пород не показали статистически значимых различий по среднему числу УЗИ-видимых фолликулов (7,33±0,62 и 6,96±0,45), получаемых (4,17±0,69 и 3,36±0,41) и пригодных ОКК (3,08±0,60 и 2,52±0,29), то есть технические (тип используемой аспирационной иглы и давление вакуума) и технологические параметры (кратность сессий) проведения OPU, оптимизированные для симментальской породы, могут быть использованы для ярославской породы без заметной потери результативности. Принимая во внимание высокую положительную корреляцию между числом пунктированных фолликулов и извлекаемых ОКК - r = 0,97 (p ≤ 0,01) и r = 0,72 (p ≤ 0,05) соответственно у телок-доноров симментальской и ярославской пород, для повышения результативности OPU целесообразно отбирать животных, характеризующихся большим числом УЗИ-видимых фолликулов.
Внеклеточные везикулы (extracellular vesicles, EVs), выделенные из фолликулярной жидкости (ФЖ) яичников, вовлечены in vivo в регуляцию мейоза в женских половых клетках, в связи с чем в последние годы EVs активно изучаются как потенциальные регуляторы качества ооцитов с целью повышения эффективности технологии получения эмбрионов in vitro (in vitro embryo production, IVP). В представленной работе мы впервые исследовали компетенцию к эмбриональному развитию у ооцитов коров ( Bos taurus ) при культивировании в присутствии EVs в процессе созревания и старении in vitro перед экстракорпоральным оплодотворением. Цель представленной работы заключалась в изучении влияния тестируемых условий на возрастные трансформации в зрелых ооцитах в процессе созревания in vitro (in vitro maturation, IVM) с точки зрения их способности после оплодотворения развиваться до стадии бластоцисты, а также качества получаемых IVP эмбрионов. EVs из ФЖ выделяли методом дифференциального ступенчатого центрифугирования и ультрацентрифугирования при 100 000 g. В полученной везикулярной фракции содержание общего белка составляло 37,5 мкг/мл ФЖ. Образцы проанализировали с использованием трансмиссионной электронной микроскопии, которая подтвердила наличие EVs, соответствующих по размерам экзосомам, в выделенных препаратах. Для функциональных экспериментов ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) культивировали с целью созревания в среде ТС-199, содержащей бычий сывороточный альбумин (3 мг/мл), пируват натрия (0,5 мМ) и эпидермальный фактор роста (EGF, 100 нг/мл) в отсутствие (контроль) или в присутствии EVs. Везикулярный белок добавляли в среду IVM в физиологической концентрации (на 1 мл среды количество EVs, выделенное из 1 мл ФЖ). Через 24 ч созревания ОКК переносили в среду старения и культивировали еще в течение 12 ч, после чего подвергали экстракорпоральному оплодотворению и культивированию для эмбрионального развития. На 3-и сут после оплодотворения изучали морфологию раздробившихся оплодотворенных ооцитов, на 7-е сут культивирования определяли число эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, и их качество. Последнее оценивали на основании общего числа ядер в эмбрионах, которое подсчитывали с помощью цитологического анализа. Всего было проведено четыре независимых эксперимента. Число ОКК в каждой экспериментальной группе варьировало от 116 до 121. Доля раздробившихся после оплодотворения ооцитов в контроле была ниже, чем в опыте (53,5±2,9 против 63,8±2,9 %, p < 0,05). Также обнаружено положительное влияние EVs на развитие созревших и стареющих in vitro ооцитов до стадии бластоцисты после оплодотворения. В контроле выход бластоцист составлял 17,3±1,6 %. Присутствие в среде созревания EVs повышало этот показатель до 26,5±0,7 % (p < 0,05), при этом качество полученных эмбрионов не ухудшалось. Полученные данные позволяют сделать вывод, что использование EVs из ФЖ яичников коров в процедуре IVM повышает устойчивость яйцеклеток к возрастным трансформациям и, как следствие, их компетенцию к эмбриональному развитию после старения in vitro и оплодотворения. Также очевидно, что EVs на этапе экстракорпорального созревания могут быть использованы для повышения эффективности технологии получения IVP эмбрионов у крупного рогатого скота.
Количество жира в молоке коров относится к признакам, наиболее подверженным высокой изменчивости, и зависит как от условий среды (кормление, технология содержания), так и от генетических факторов (порода, генотип). Особый интерес представляет содержание жирных кислот (ЖК) как биомаркера контроля физиологического состояния животных и критерия оценки показателей качества сырого молока, в части его пригодности к переработке (выход сыра, масла и сливок). Соотношение ЖК в молоке по числу атомов углерода, а также длине цепи, степени ее насыщения различается между особями и на популяционном уровне. Поэтому изучение генетической и геномной изменчивости признаков молочной продуктивности для повышения эффективности управления отбором животных остается актуальной задачей. Цель наших исследований заключалась в поиске полногеномных ассоциаций и полиморфизмов в генах, детерминирующих жирнокислотный состав молока, на основе инфракрасной спектрометрии как одного из наиболее быстрых и точных экспресс-методов физико-химического анализа состава молока. Популяционно-генетические параметры и изменчивость содержания жирных кислот в молоке изучали на популяции голштинизированного черно-пестрого и голштинского скота 14 племенных стад из Московской области (2017-2018 годы). Всего для оценки суточных показателей молочной продуктивности использовали 36982 образца. Расчет коэффициентов наследуемости (h2) и корреляции ( rg ) показателей состава молока коров проводили на основе метода REML (residual maximum likelihood) с использованием семейства программ BLUPF90. Поиск SNP проводили в выборке коров из экспериментального стада голштинизированного черно-пестрого скота (ПЗ «Ладожский» - филиал ФГБНУ ФИЦ ВИЖ им. Л. К. Эрнста, 2020-2021 годы). Фракционный состав молока определяли с помощью автоматического анализатора MilkoScan 7 DC («FOSS», Дания), принцип действия которого основан на экспресс-оценке методом инфракрасной спектроскопии. При индивидуальной оценке была сформирована группа из 144 генотипированных с помощью биочипа Bovine GGP 150K («Neogen», США) коров с полным фенотипическим описанием спектра жирных кислот и компонентов молока. Контроль качества генотипирования (110884 SNP), анализ полногеномных ассоциаций (GWAS, genome-wide association study) и многомерное шкалирование (MDS, multidimensional scaling) выполняли с помощью программы Plink 1.9. Поиск генов по выявленным значимым полиморфизмам проводили в браузере Ensembl по сборке генома крупного рогатого скота Bos taurus UMD 3.1.1 (https://www. ncbi. nlm. nih. gov/assembly/). Аннотацию генов для определения локусов количественных признаков на хромосомах животных осуществляли по международной базе данных Animal QTLdb. Наследуемость показателей жирных кислот молока варьировала от низкой для полиненасыщенных ЖК (h2 = 0,018) до умеренных для средне- (h2 = 0,125), длинноцепочечных (h2 = 0,155) и миристиновой кислоты (h2 = 0,155), мононенасыщенных ЖК (h2 = 0,176) и олеиновой кислоты (h2 = 0,196). Методом многомерного шкалирования оценили генетическую структуру экспериментальной группы животных, где мы наблюдали умеренный размах вариабельности по первой (PC1 = 7,82 %) и по второй (PC2 = 4,65 %) компонентам изменчивости. Для миристиновой и пальмитиновой ЖК выявлены общие кластеры (QTL) на хромосомах BTA5, BTA10, BTA14, BTA18 и BTA27; для стеариновой и олеиновой ЖК (как входящих в группу длинноцепочечные ЖК) показана схожая локализация QTL на хромосомах BTA9, BTA10, BTA11, BTA14, BTA17, BTA18, BTA19, BTA20 и BTA29. Для коротко- и среднецепочечных ЖК обнаружены ассоциации на хромосомах BTA1, BTA5, BTA10, BTA11, BTA14, BTA18, BTA19 и BTA24, для длинноцепочечных ЖК детектированы QTL на BTA6, BTA7, BTA9, BTA10, BTA11, BTA17, BTA18 и BTA29. Для коротко- и среднецепочечных ЖК, насыщенных ЖК, C14:0, C16:0, C18:0 и C18:1 установлены гены, образующие QTL на хромосомах BTA10, BTA11 и BTA14, - CACNA1C, GCH1, ATG14, KCNH5, PRKCE, CTNNA2, CYHR1, VPS28, DGAT1, ZC3H3, RHPN1, TSNARE1. Коротко- и среднецепочечные ЖК, миристиновая и пальмитиновая ЖК, насыщенные ЖК показали связь с полиморфизмами в генах MED12L, EPHB1, GRIN2B, PRMT8, ERC1, PELI2, ARHGAP39, MROH1, MAF1, GSDMD, LY6D. Для длинноцепочечных и мононенасыщенных ЖК, стеариновой и олеиновой ЖК в результате аннотации получены селекционно значимые гены RPS6KA2, CPQ, CPE, FTO, FAT3, LUZP2. Продолжение изучения генетических механизмов наследования содержания жирных кислот и компонентов молока необходимо для формирования стратегии селекции молочного скота с лучшим жирнокислотным профилем и составом компонентов.