К моменту открытия библиотека располагала обширным собранием книг (до 2800 наименований около 7,5 тыс. томов), а также рукописных, изобразительных и иных материалов.
В становлении и развитии библиотеки значительную роль сыграли известные своими гражданскими инициативами жители города М.Ф. Де-Пуле, А.В. Станкевич, А.И. Ватаци, А.В. Веневитинов, жертвователи и попечители — Г.А. Чертков, А.М. Раевская, Д.Н. Шереметев, В.Я. Тулинов, П.И. Савостьянов, А.Л. Потапов, председатели и члены Комитета по управлению библиотекой и их сподвижники — М.Н. Нечаев, К.В. Федяевский, Г.С. Вашкевич, В.И. Колюбакин и др., одни из первых работников библиотеки — А.И. Селиванов (бывший 1-м хранителем), Д.И. Самбикин, Р.Ф. Вознесенская, Л.И. Булавкина.
В конце XIX — начале ХХ вв. существовало три филиала библиотеки в Воронеже и один — в Боброве, загородный абонемент, отделение в Нижнедевицке.
После Октябрьской революции библиотека из общественной стала государственным учреждением. В 1919 году ей было присвоено имя Я.М. Свердлова.
В 1932 году библиотека была реорганизована в Областную публичную библиотеку, начала получать обязательный экземпляр всей книжной продукции РСФСР, стала выполнять функции методического центра по руководству библиотеками области.
В годы Великой Отечественной войны (1942 г.) фонд библиотеки (в 1939 году он составлял 600 тысяч экземпляров) был почти полностью утрачен. Вновь библиотека открылась в 1944 году.
15 октября 1963 года Областной библиотеке было присвоено имя воронежского поэта Ивана Саввича Никитина. В 1965 году библиотека получила статус научной, с 1975 года является депозитарием Центрально-Черноземной зоны Российской Федерации.
С 1991 года библиотека приступила к реализации проекта автоматизации библиотеки, с 1998 года — проекта создания единой региональной библиотечной компьютерной сети.
Библиотека сегодня — это информационное, культурное, образовательное учреждение; центральное хранилище универсального собрания документов; центр краеведения, библиографии; научный и организационно-методический центр для муниципальных библиотек области; центр автоматизированной библиотечно-информационной системы муниципальных библиотек региона. Технологии основных библиотечно-информационных процессов автоматизированы, осуществлен выход в мировую информационную сеть Интернет.
С 2001 года областная библиотека имени И.С. Никитина является членом Российской библиотечной ассоциации, с 2004 года — корпоративной библиотечной системы «Черноземье».
Фонд библиотеки насчитывает более 3-х млн. разнообразных печатных, аудиовизуальных и электронных материалов. Ценной частью фонда является коллекция воронежского писателя и литературоведа О.Г. Ласунского (около 800 ед. хр.), содержащая книги с авторскими дарственными надписями и маргиналиями, первые труды Воронежской губернской типографии, буклеты, открытки и иные печатные материалы преимущественно краеведческого характера.
Библиотекой ежегодно пользуется свыше 59 тыс. человек, которым выдается около 2 млн. единиц хранения.