В и р о и д ру б це в ат о с т и п л одо в я б л о н и (Apscaviroid cicatricimali, Apple scar skin viroid, ASSVd) является одним из особо опасных фитопатогенов, поражающих семечковые и косточковые плодовые культуры. Вироидная инфекция представляет потенциальную опасность, которая может нанести экономический ущерб производству плодовых культур. Наиболее распространенным способом передачи ASSVd является контактная передача (механически через рабочие инструменты), а также через прививку (от зараженного растения к здоровому). В статье приведена краткая обзорная информация по вироиду, а также показаны данные по апробации олигонуклеотидов для диагностики ASSVd методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦРРВ) с использованием отечественных реактивов.
Проверку работы олигонуклеотидов осуществляли с помощью отечественных наборов реагентов компании ООО «НПФ Синтол» и ЗАО «Евроген». Для проведения экспериментов по оценке специфичности праймеров использовали различные изоляты близкородственных вироидов из семейств Avsunviroidae и Pospiviroidae. В данной работе проведен анализ олигонуклеотидов с использованием онлайн-сервиса NCBI Primer-BLAST. В исследовании проведено множественное выравнивание нук леотидных последовательностей изолятов вироида рубцеватости плодов яблони с помощью специальных программ MAFFT и AliView. Биоинформатически проанализированы видоспецифичные олигонуклеотиды на возможность образования вторичных структур – шпилек и димеров, которые могут повлиять на диагностику фитопатогена. Установлено, что праймеры cASSVd/hASSVd и ASS-F/ASS-R способны образовывать большое количество вторичных структур, которые могут привести к ложноположительному результату. С помощью праймеров ASSVd-F91/ASSVd-R291, ASS-F/ASS-R и зонда ASS-Р возможно идентифицировать вироид рубцеватости плодов яблони методом ПЦР-РВ.
Вирус полосатой мозаики пшеницы (Wheat streak mosaic v irus, или Tritimovirus tritici; акроним – WSMV) является вредоносным патогеном пшеницы, кукурузы, овса, проса, ржи, сорго, тритикале, ячменя и многочисленных видов многолетних злаковых трав. Потери урожая пшеницы в результате заражения этим вирусом могут достигать 100%. WSMV распространяется контактным способом, с семенами и пшеничным завитушным клещом Aceria tosichella Keifer. Положение об отсутствии этого вируса содержится в фитосанитарных требованиях 16 стран – импортеров российской зерновой продукции.
Для разработки методических рекомендаций по выявлению и идентификации WSMV было проведено испытание трех тест-систем для ИФА ведущих фирм-производителей, четырех тест-систем для ПЦР в «реальном времени» (ОТ-ПЦР-РВ) и восьми пар праймеров для классической ОТ-ПЦР. Установлен достаточно высокий уровень специфичности к целевому объекту у тест-систем для ИФА к WSMV фирм Agdia, DSMZ и Loewe. Совпадения результатов серологических тестов с тест-системой фирмы Agdia и результатов молекулярных тестов составило 90,5–100%, что позволяет рекомендовать данную тест-систему для проведения скрининговых тестов на наличие WSMV. Установлено, что наборы реагентов для ПЦР-РВ к WSMV отечественных фирм-производителей могут быть рекомендованы для проведения скрининговых тестов на наличие WSMV при проведении фитосанитарного мониторинга посевов и для анализа семян зерновых культур, предназначенных для использования внутри Российской Федерации. Для анализа зерновой продукции, предназначенной для экспорта, альтернативой методу ИФА может являться тест в формате одноэтапной ОТ-ПЦРРВ с праймерами и зондом W SMV F 1/WSMV R 1/ WSMV P. Для проведения подтверждающих тестов на наличие WSMV отработан протокол одноэтапной классической ОТ-ПЦР с праймерами PMB-70/ PMB-71, не уступающий по чувствительности тестам методом ПЦР в «реальном времени». Установлена возможность использования праймеров WSMV-F/WSMV-R и WSMVL2/WSMVR2 в качестве подтверждающих тестов. Для изучения генетических особенностей у выявляемых изолятов в качестве дополнительных тестов целесообразно использовать праймеры WSMV-CP-AM-F2/WSMVCPAM-R и WSMV-CP-Czech-F/WSMV-CP-Czech-R, которые амплифицируют полные последовательности нуклеотидов генов белка оболочки изолятов штаммов WSMV-D и WSMV-B соответственно.
Возбудитель желтого слизистого бактериоза пшеницы Rathayibacter tritici (Carlson & Vidaver) Zgurskaya et al. входит в Единый перечень карантинных объектов Евразийского экономического союза. Быстрая идентификация возбудителя является важным элементом в сфере карантина растений. Метод ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) наиболее оптимален при проведении лабораторной диагностики. В настоящий момент существует только два теста ПЦР-РВ для идентификации Rathayibacter tritici, разработанные Postnikova et al., 2017. Тесты предназначены для идентификации Rathayibacter tritici в чистых бактериальных культурах. Сведения о значениях основных параметров применимости теста ПЦР-РВ – аналитической специфичности, включая эксклюзивность и инклюзивность, и аналитической чувствительности, – а также об испытаниях теста для обнаружения патогена в растительных образцах в оригинальной статье отсутствуют. Целью настоящей работы являлась оценка применимости ранее известных тестов ПЦР-РВ для идентификации R. tritici. Материалами исследований являлись штаммы R. tritici, а также 26 штаммов бактерий рода Rathayibacter, включая все существующие виды внутри указанного рода. В результате оценки применимости тестов ПЦР-РВ для идентификации возбудителя желтого слизистого бактериоза пшеницы Rathayibacter tritici было установлено, что значение инклюзивности – способности теста идентифицировать все многообразие штаммов бактерии внутри вида – для исследуемых тестов составляет 83,3%. Использование указанных тестов позволило идентифицировать 5 из 6 штаммов целевого объекта – Rathayibacter tritici. Значение эксклюзивности – способности теста отличать целевые штаммы от нецелевых – составило 100% для обоих тестов. Тесты ПЦР-РВ, разработанные Postnikova et al., 2017, несмотря на их высокую эксклюзивность (100%), неприменимы для фитосанитарной диагностики, поскольку в случае их применения достаточно высоким является риск ложноотрицательных результатов и, как следствие, проникновения карантинного фитопатогена на новые территории.
Вирус коричневой морщинистости плодов томата (Tomato brown rugose fruit virus, или Tobamovirus fructirugosum, ToBRFV) является карантинным объектом ЕАЭС, ЕОКЗР и целого ряда стран мира. Вирус заражает томат, перец и несколько видов сорных растений. Потери урожая плодов томата в результате заражения ToBRFV могут достигать 70%. Из-за развития интенсивной некротизации и деформации плоды зараженных растений становятся непригодными для продажи.
Вирус коричневой морщинистости плодов томата характеризуется многообразием путей распространения и способен длительное время сохраняться в растительных остатках, почве, воде, растворах для гидропоники и на различных инертных поверхностях. Важное значение в распространении вируса коричневой морщинистости плодов томата имеет семенная инфекция.
В соответствии с национальным докладом в Российской Федерации вирус коричневой морщинистости плодов томата впервые был выявлен в 2023 г., что обусловило необходимость установления 5 карантинных фитосанитарных зон в 4 субъектах Российской Федерации. В 2024 г. наблюдалось дальнейшее расширение его ареала.
Важнейшей предпосылкой для предотвращения распространения фитопатогенных вирусов является установление источников их инфекции, что может быть достигнуто сравнением последовательности нуклеотидов у выявленных изолятови изолятов данного патогена различного географического происхождения.
В настоящей статье приведены результаты изучения генетических особенностей изолятов вируса коричневой морщинистости плодов томата, выявленных в Ставропольском крае, Волгоградской и Московской областях, Республике Казахстан и Республике Узбекистан.